微生物组测序数据清洗，从原始数据到高质量分析

微生物组测序数据清洗是从原始测序数据中去除低质量序列、污染和噪音，以获得高质量数据的关键步骤，该过程通常包括质量控制、去冗余、去宿主序列、去除接头和引物序列等环节，使用FastQC等工具评估原始数据质量，随后通过Trimmomatic或Cutadapt等软件去除低质量碱基、接头序列和短读长，对于宿主污染（如人类基因组），可采用Bowtie2等比对工具进行过滤，还需通过去冗余和嵌合体检测（如UCHIME）进一步提高数据可靠性，经过清洗的高质量数据可用于后续的物种注释、功能预测和多样性分析等研究，这一流程对确保微生物组研究的准确性和可重复性至关重要。

微生物组（Microbiome）研究近年来在医学、环境科学和农业等领域取得了重要进展，高通量测序技术（如16S rRNA测序或宏基因组测序）能够快速获取样本中的微生物群落信息，但原始测序数据往往包含噪声、低质量序列和污染，直接影响后续分析的准确性。数据清洗（Data Cleaning） 是微生物组分析的关键步骤。

本文将介绍微生物组测序数据清洗的基本流程，帮助初学者理解如何从原始数据中提取高质量信息，为后续的物种注释、功能预测和统计分析奠定基础。

原始数据格式与常见问题

微生物组测序数据通常以 FASTQ 格式存储，包含测序序列（Reads）及其对应的质量分数（Quality Scores），常见的数据质量问题包括：

• 低质量碱基（Low-quality bases）：测序过程中可能产生错误碱基，影响序列比对和注释。
• 接头污染（Adapter contamination）：测序过程中残留的引物或接头序列。
• 嵌合体（Chimeras）：PCR扩增时产生的非目标序列。
• 宿主污染（Host contamination）：如人类肠道微生物组测序中可能混入人类DNA。

数据清洗流程

微生物组测序数据清洗通常包括以下步骤：

（1）质量评估（Quality Control）

使用工具（如 FastQC）检查原始数据的质量分布，包括：

• 每个碱基的质量分数（Phred Score）：一般要求Q30（错误率≤0.1%）以上。
• 序列长度分布：过短或过长的序列可能有问题。
• GC含量异常：某些微生物的GC含量异常可能表明污染。

示例命令（FastQC）：

fastqc raw_data.fastq -o output_dir/

（2）去接头与低质量序列过滤

使用 Cutadapt 或 Trimmomatic 去除接头序列并过滤低质量Reads：

• 去除测序接头（Adapter）
• 截断低质量碱基（如Q<20）
• 丢弃过短序列（如长度<50bp）

示例命令（Cutadapt）：

cutadapt -a ADAPTER_SEQ -q 20 -m 50 -o cleaned.fastq raw_data.fastq

（3）去宿主污染（Host Removal）

如果样本来自人体或动物（如肠道、皮肤微生物组），可能需要去除宿主DNA，常用工具：

• Bowtie2（比对宿主基因组并去除匹配序列）
• KneadData（自动化去宿主流程）

示例命令（Bowtie2）：

bowtie2 -x host_genome -U cleaned.fastq --un non_host.fastq > host_mapped.sam

（4）去重复序列（Dereplication）

PCR扩增可能导致相同序列被多次测序，可使用 VSEARCH 或 USEARCH 去除冗余序列：

vsearch --derep_fulllength input.fasta --output unique.fasta --sizeout

（5）嵌合体去除（Chimera Removal）

嵌合体（Chimeras）是PCR扩增时产生的假序列，需用 UCHIME 或 VSEARCH 检测并去除：

vsearch --uchime_denovo unique.fasta --nonchimeras final.fasta

（6）OTU/ASV聚类（可选）

• OTU（Operational Taxonomic Unit）：基于97%相似度聚类（如 USEARCH）。
• ASV（Amplicon Sequence Variant）：更精确的序列变异识别（如 DADA2、Deblur）。

示例（DADA2 in R）：

library(dada2)
filtered <- filterAndTrim(raw_reads, filtered_reads, maxN=0, maxEE=2, truncQ=2)
derep <- derepFastq(filtered_reads)
dada <- dada(derep, err=learnErrors(derep))
seqtab <- makeSequenceTable(dada)

数据清洗后的验证

清洗后的数据应再次进行质量检查，确保：

• 平均质量分数达标（Q30+）。
• 序列长度符合预期（如16S V4区~250bp）。
• 嵌合体比例<1%。
• 宿主污染基本去除（如人类DNA残留<0.1%）。

工具推荐：

• MultiQC（整合FastQC、Cutadapt等报告）
• Kraken2（快速检测污染物种）

常见问题与优化建议

• 问题1：数据丢失过多？ → 调整过滤阈值（如放宽Q值或最小长度）。
• 问题2：嵌合体比例高？ → 优化PCR条件或使用更严格的去嵌合体方法。
• 问题3：计算资源不足？ → 使用云计算（如AWS、Google Cloud）或降低数据量（随机抽样）。

微生物组测序数据清洗是确保分析可靠性的关键步骤，本文介绍了从原始FASTQ数据到高质量序列的标准流程，包括：

1. 质量评估（FastQC）
2. 去接头与过滤（Cutadapt/Trimmomatic）
3. 去宿主污染（Bowtie2/KneadData）
4. 去嵌合体（UCHIME/VSEARCH）
5. OTU/ASV聚类（DADA2/USEARCH）

通过严格的清洗流程，可以提高后续物种注释、α/β多样性分析和功能预测的准确性，希望这篇指南能帮助初学者更好地处理微生物组数据！

参考文献与工具推荐

• Andrews, S. (2010). FastQC.
• Martin, M. (2011). Cutadapt.
• Callahan, B. J. (2016). DADA2.
• Edgar, R. C. (2010). UCHIME.

如果你有疑问或建议，欢迎留言讨论！ 🚀